本文来源：中华内分泌代谢杂志,,34(11):-.
性发育异常疾病(Disordersofsexualdevelopment,DSD)是一组由于染色体畸变或单基因突变等导致的性别决定和性别分化异常的罕见病，多数与基因突变有关，在人群中的发病率约为1/，以染色体性别、性腺性别和外生殖器性别之间不一致为主要临床表现。DSD的分子病因较为复杂，以往采用Sanger测序的方法进行基因诊断，不仅费时费力，而且由于临床表型存在广泛的异质性，诊断率一直处于较低水平，仅有20%左右的患者可获得精确的分子诊断，严重影响患者的性别选择、性心理发展以及长期的治疗方案，给患者及其家庭带来巨大的生活和心理负担。近年来，得益于基因组学的快速发展，新一代测序技术为摆脱当前基因诊断困境提供了一种更为行之有效的方法和手段，极大地缩短患者诊断周期，提高诊断率，也为多学科联合诊疗(MDT)提供了新的平台和基础，为广大DSD患者带来福音。
性发育过程及重要的参与基因
哺乳动物的性发育主要包括性别决定和性别分化两个层面。性别决定是由具有双向分化潜能的原始性腺原基分化为睾丸或者卵巢的过程，而性别分化则在分化成熟的性腺组织分泌的类固醇激素以及其他激素作用下，实现外生殖器及外生殖器管道的分化。在此过程中，均存在由许多分子或激素构成的复杂调控网络。性发育过程中任何基因或分子缺陷都可能导致性发育异常疾病的发生。
1．性别决定：
在性别决定中，Y染色体上睾丸的性别决定基因(Sex-determiningRegionofY-chromosome,SRY)启动了具有双向分化潜能的原始性腺原基分化为睾丸，在无SRY基因存在的46，XX个体，原始性腺则分化为卵巢。目前认为，SRY基因通过激活下游性别决定区Y框蛋白9(Sex-determiningRegionYBoxProtein9，SOX9)基因表达启动睾丸组织的分化，SOX9基因决定前支持细胞的分化方向，包括Sertoli细胞(支持细胞)和精曲小管的形成。在睾丸分化过程中，许多因子对SRY激活至关重要，如Wilms肿瘤相关基因1(Wilms′Tumor1,WT1)，Chromobox同源蛋白2(ChromoboxHomolog2,CBX2)，类固醇生成因子1(SteroidogenicFactor1,NR5A1)，GATA结合蛋白4(GATABindingProtein4,GATA4)/锌指蛋白Fog家族2(ZincFingerProteinFOGFamilyMember2,FOG-2)等。转录因子NR5A1、WT1与GATA4等可协同促进睾丸Sertoli细胞的前体细胞SRY基因表达增加，促使睾丸发育。SOX9上调纤维母细胞生长因子9(FibroblastGrowthFactor9,Fgf9)/纤维母细胞生长因子受体2(FibroblastGrowthFactorReceptor2,Fgfr2)和前列腺素D2(ProstaglandinD2,PGD2)基因表达，它们的激活状态可维持SOX9表达，形成正反馈。以往认为，卵巢发育是由于SRY基因缺省的被动过程。近年来，随着研究的深入，一些涉及卵巢分化的因子逐步被发现。与睾丸生成不同，卵巢生成依赖于Wnt家族蛋白4(WntFamilyMember4,Wnt4)/R-脊椎蛋白1(R-spondin1,Rspo1)/β-连环蛋白(β-catenine)信号通路，通过抑制SOX9基因表达促进卵巢分化；而颗粒细胞增殖分化需要其他因子的作用，如叉头框L2基因(ForkheadBoxL2,Foxl2)和雌激素受体α或β。核受体亚家族0B组成员1(nuclearreceptorsubfamily0groupBmember1,Dax-1)基因为睾丸发育所必需，但X染色体上该基因的重复导致46，XX性反转。睾丸或卵巢分化过程中上述基因缺陷都可引起性腺发育不良，导致DSD疾病的发生。
2．性别分化：
从胚胎第7周开始，睾丸支持细胞分泌的Müllerian管抑制因子(MIF，也称AMH)，使发育为子宫、输卵管和阴道上1/3的Müllerian管(也称副中肾管)结构退化；其后间质细胞分泌的雄激素(主要为睾酮)，则引起Wolffian管(也称中肾管)结构发育为附睾、输精管和精囊；在5α-还原酶2型(steroid5alpha-reductase2,SRD5A2)的作用下，睾酮转化为双氢睾酮，使前列腺和外生殖器男性化。AMH分泌缺陷使得Müllerian管结构持续存在，形成输卵管、子宫和阴道上1/3部分；局部睾酮缺乏导致中肾管结构退化；尿生殖窦发育为尿道和下部分阴道，生殖结节形成肥大阴蒂，尿道摺发育类似小阴唇，阴唇阴囊隆起形成大阴唇。生殖管道及外生殖器男性化主要依靠雄激素的合成及作用，多种因子缺陷常引起男性化不足，包括雄激素受体(androgenreceptor,AR)缺陷，5α－还原酶2型缺陷，17α羟化酶/17，20裂解酶(CytochromePfamily17subfamilyAmember1,CYP17A1)缺陷，17β-羟基类固醇脱氢酶3(hydroxysteroid17-betadehydrogenase3,HSD17B3)缺陷和黄体生成素受体(luteinizinghormone/choriogonadotropinreceptor,LHCGR)缺陷等，而21-羟化酶(cytochromePfamily21subfamilyAmember2,CYP21A2)和芳香化酶(cytochromePfamily19subfamilyAmember1,CYP19A1)缺陷可导致女性外生殖器男性化。
性发育异常疾病的分类
目前，关于DSD的分类主要依据欧洲儿科内分泌协会和LawsonWilkins儿科内分泌学会在年颁布的一项共识，将DSD疾病分为性染色体异常的DSD、46，XYDSD和46，XXDSD三类。性染色体异常包括45，X(Turner综合征及其亚型)、47，XXY(Kilnefelter综合征及其亚型)、45，X/46，XY(混合型性腺发育不良)及46，XX/46，XY(嵌合体)。46，XYDSD分性腺(睾丸)发育异常，雄激素合成或功能异常及其它如泄殖腔外翻或环境干扰物等。性腺发育异常分完全型或部分型性腺发育不良、卵睾性DSD和性腺退化；雄激素合成或功能异常主要包括雄激素不敏感综合征、5α-还原酶2型缺陷、LH受体缺陷等。46，XXDSD则分为性腺(卵巢)发育异常、胎儿期雄激素过多及其它如子宫异常或苗勒管不发育/发育不全等。与46，XYDSD类似，卵巢发育异常同样包括性腺发育不全、卵睾性DSD和睾丸性DSD；根据其来源，胎儿期雄激素过多可分为胚胎性如21-羟化酶缺陷、11β-羟化酶缺陷(CytochromePFamily11SubfamilyBMember1,CYP11B1)，胚胎胎盘性如芳香化酶缺陷症、氧化还原酶缺陷症(CytochromePOxidoreductase,POR)和母体性如黄体瘤或雄激素类药物作用。此种分类方法主要依据患者染色体核型结合临床资料，然而，每种类型包含多种病因分类，如46，XYDSD，病因多达数十种；尤其是性腺发育不良及卵睾性DSD，其分类较为模糊。此种分类方法对于治疗方案的选择，提示意义也较为欠缺。
DSD传统的基因诊断及
新形式下第二代测序技术的应用
1．传统的基因诊断方法：
以往对于DSD的诊断主要依据患者的临床表型和生化结果选定候选基因，采用一代测序(Sanger测序)的方法进行测序。对发现的突变位点可以进行致病性预测、计算机蛋白空间结构分析和体内外功能研究以明确其致病性。然而，DSD患者临床表型存在广泛异质性，相同基因突变的患者可表现为不同程度的性发育异常，如NR5A1基因突变，可引起男性完全型或部分型性腺发育不良伴或未伴有肾上腺功能减退和男性不育，更有甚者导致46，XX睾丸性(卵睾性)DSD和女性卵巢功能早衰；而不同基因突变患者可表现为相似的临床表型，如AR基因突变导致的部分型雄激素不敏感综合征则难与SRD5A2基因突变导致的5α-还原酶2型缺陷症相鉴别。如此，仅凭临床表型及内分泌激素水平难以快速准确地选定候选基因。采用候选基因Sanger测序的方法进行诊断，不仅费时费力，而且诊断率低。特别是对46，XYDSD患者而言，其病因非常复杂，一代测序诊断率仅为20%左右。
2．新形势下第二代测序技术的应用：
第二代测序技术是相对于Sanger测序技术而言的。二代测序技术的主要技术革新有：(1)采用矩阵分析技术，可同时进行多DNA样本的分析；(2)不再采用电泳技术，使得测序仪微型化，大大降低成本；(3)采用边合成边测序的方法，大幅度提升测序速度。与Sanger测序相比，第二代测序单次运行所产的数据量大，故又称为高通量测序技术。自从年出现以来，第二代测序技术在基因组从头测序、基因组重测序和转录组测序(RNA-seq)等方面开始应用。年，美国国立卫生研究院(NIH)的"未确诊疾病计划"(UndiagnosedDiseasesProgram)开始以前所未有的规模向临床提供基因组学研究。近年来，随着二代测序技术的迅猛发展，靶向基因组测序或者全外显子组测序日臻成熟，使遗传性疾病进展迅速，预示着精准医学时代的到来。
(1)国内外研究概况：第二代测序技术的应用给DSD研究领域也带来了巨大发展。根据年美国医学遗传学和基因组学(ACMG)颁布的指南，将突变位点分成5类：致病的、可能致病的、临床意义不明确的、可能良性的和良性的。除此之外，还可以选择3种在线软件(SIFT，PolyPhen2和MutationTaster)对突变位点进行致病性预测。若突变位点为先前已经报道的突变，且临床表现与疾病相关，可认为是致病的；而新发现的突变位点，被3种预测软件中2种及以上预测为致病的，且该基因与临床表型相关，认为是可能致病的；除此之外，其他一些突变位点被认为是临床意义不明确的。
年，Baxter等对40例基因诊断未明确的46，XYDSD患者采用外显子组测序方法，并对64个DSD候选基因的测序数据进行提取分析。40例患者中表现为女性外生殖器伴或未伴有阴蒂肥大的有21例；外生殖器介于两性之间的12例；而以男性外生殖器为主伴或未伴有小阴茎的有7例。研究表明，35%的患者(14例)基因诊断明确，其中9例患者发现致病性突变，5例为可能致病性突变；另外有6例患者发现临床意义不明的突变。年，另一项大型国际研究选择了64个候选基因，对例46，XYDSD患者和48例46，XXDSD患者分别进行靶向基因组测序，发现46，XYDSD患者中AR，NR5A1和SRD5A2三种基因的突变最为常见，57%的患者发现与临床相关的DSD致病基因的突变，诊断率为43%；其中，76例患者携带致病的基因变异(48%)，42例为可能致病的基因变异(26%)，41例为临床意义不明的变异(VUS；26%)。而在46，XXDSD中，9例患者发生变异，其中8例为SRY基因异位。由此可见，靶向二代测序技术在46，XYDSD中的诊断价值远远高于46，XXDSD患者。特别是对46，XYDSD性腺发育不良患者，其病因极其复杂，尤其是与卵巢发育有关基因(SOX9，ROSP-1和FGF9等)的拷贝数变异(CNV)，而靶向测序方法目前对于拷贝数变异的检测还有一定缺陷。近来，国内外陆续也有文献报道指出运用靶向二代测序技术策略确可提高DSD患者的诊断率。近年，英国内分泌协会的DSD指南，建议对合并其他畸形的患儿进行Array-CGH拷贝数变异的检测。
低促性腺激素性性腺功能减退(HH)和卡尔曼综合征(KS)是一组罕见的遗传性疾病，患者主要表现为正常青春期发育受阻及不育，伴(或不伴有)嗅觉减退等；激素检测显示低或正常的促性腺激素和性激素。随着第二代测序技术的应用，HH和KS新的潜在致病基因不断涌现。年，一项针对58例HH患者进行的拷贝数变异分析和29个已知HH致病基因的突变筛查研究发现，14例患者携带有致病性缺陷，包括FGFR1基因和SOX3基因的缺失和WDR11基因的剪切位点突变。结果表明，已知致病基因的缺陷仅能解释小部分HH患者，大部分患者分子病因仍然未知。由此，更大规模的基因测序甚至是全外显子测序显得尤为重要。年，Quaynor等收集48例患者(男性17例，女性31例)进行个基因的靶向二代测序，发现了18个新的HH候选基因；同时，16.7%(8/48)的患者携带2个基因突变，2.1%(1/48)的患者带有3个基因突变。二代测序技术的广泛应用使得多基因突变的检出率急剧增加，HH的遗传方式也发生变化。除传统的孟德尔遗传之外，多基因遗传模式也可能参与其致病过程，为这种疾病的遗传咨询带来更大挑战。目前，遗传性疾病研究中面临的主要问题是如何从患者发现的多种罕见突变中区分出真正的致病性突变。
(2)靶向二代测序技术对46，XY性发育异常的研究：在对临床资料进行充分评估之后，我们选用富鲁达公司的微阵列芯片系统(AccessArraySystem)对70例基因诊断未明确的46，XYDSD患者进行80个基因个外显子区域的捕获。80个基因中包括33个DSD候选基因，以及47个在动物模型中发现与性腺发育相关但未在DSD患者中报道突变的基因。这些基因按照其功能主要分成三类：与性腺发育相关，与性分化相关(类固醇激素合成及受体)以及其他与中枢性性腺功能减退、单纯性尿道下裂和综合征相关DSD的致病基因。文库构建之后，使用Illumina公司的Hiseq测序仪进行测序，并经过一系列生物信息学分析和Sanger测序进行验证。结果发现，共在52例患者中检测到个突变，主要分布在40个基因；包括86个新发突变和27个先前已报道过的突变。37个突变发生在19个以往未在46，XYDSD患者中发现的基因里，包括EGF、LHX9和CST9等。
70例患者中最常见的三种突变基因分别为AR、NR5A1和SRD5A2，诊断率可达到43%(30/70)，均与先前的一项大型国际研究结果相吻合。以往认为DSD是一种单基因突变导致的遗传性疾病；然而，在我们研究中却发现47%(33/70)的患者存在双(多)个基因的突变。患者多个突变基因的发现提示DSD可能存在一种潜在的双基因(多基因)遗传模式，不同缺陷基因共同发挥作用导致错综复杂的临床表型。由此，可以推断相同基因突变导致的表型异质性可能与多基因突变有关。我们的研究揭示了中国人46，XYDSD患者的遗传规律的复杂性，扩大了该疾病的候选基因谱；并提出一种潜在的双基因(多基因)遗传模式。这种遗传模式的揭示，对患者长期治疗方案的选择、性别决定和遗传咨询都将有重要的指导作用。当然，在这组70例患者中，有18例未发现基因突变，考虑可能与新的DSD致病基因未发现、测序结果的阳性结果筛选标准以及未检测拷贝数变异情况等有关。因此，靶向二代测序技术克服了Sanger测序法低效率、相对高成本的缺点，极大地提高了患者的诊断率，在阐明疾病的遗传特征并发现新的DSD致病基因方面发挥着重要作用。
靶向二代测序与全外显子组
乃至全基因组测序的选择
随着测序技术的日臻成熟及成本的急剧下降，全外显子组测序甚至是全基因组测序数据层出不穷。作为检测基因组变异的"金标准"，全基因组测序可以检测所有的变异类型，包括染色体结构重排，拷贝数变异，单核苷酸变异及小片段插入和缺失。相比较而言，全外显子组测序仅能检测人类全基因组1%～2%的外显子区域，检测类型主要是单核苷酸变异及小片段插入和缺失。到目前为止，我们在遗传性疾病中检测到的大部分突变都位于编码区，而且我们也建立了稳定的实验流程和功能预测程序以探究突变型氨基酸对蛋白质功能的影响。因此，除去成本因素，考虑到编码区突变的重要意义及突变类型易于解释，在研究遗传性疾病过程中，我们偏向于选择全外显子组测序的方法。近年，通过外显子组测序的方法，在多例46，XYDSD患者中，发现了DesertHedgehog(DHH)基因突变以及雌激素受体2(ESR2)基因的突变，提示两种基因均参与早期睾丸的分化和发育。
然而，相比较庞大的全外显子组测序数据而言，靶向测序的优势不言而喻，不仅可以缩短数据分析时间，节省大量的人力和财力，并且可以快速诊断患者，缩短诊疗周期。值得注意的是，靶向外显子组测序对于检测已知基因的变异，有强大的优势，但无法发现疾病新的致病基因，且对拓宽疾病基因型-表型之间联系的作用有限。因此，如何选取适合的测序方法，除了需要考虑成本因素之外，同时需要注意研究的目的性和患者家系中遗传情况等。
第二代测序技术
对DSD诊断和治疗的意义
DSD是一种复杂的遗传病，其诊疗方法根据不同的分子病因有所不同。新一代测序技术的出现，有助于DSD患者的早期诊断、性别选择以及多学科团队(MDT)长期治疗方案制定。对于46，XYDSD的常见病因，如5α-还原酶2型缺陷症患者由于双氢睾酮生成障碍，出生时常伴有小阴茎、尿道下裂等男性化不足表现；患者出生后常以女性社会性别抚养，青春期后多数患者出现男性第二性征发育后，倾向于将社会性别改为男性。早期诊断不仅有助于性别确认，减少对患者的心理影响，且可在婴儿期或儿童期尿道下裂修补术前外用双氢睾酮治疗，可提高手术的成功率，减少并发症。雄激素不敏感综合征患者雄激素受体抵抗程度不同，对完全型患者而言，临床表型接近于女性，虽然目前对于性腺切除的年龄还有争议，但社会性别选择以女性为主。部分型雄激素不敏感综合征患者表型具有很大异质性，其性别选择并不唯一；大部分患者作为男性社会性别抚养，手术治疗包括睾丸固定术、阴茎弯曲矫正以及针对尿道下裂而进行的尿道重建。早期明确诊断结合雄激素受体的功能评估，对于患者的性别选择和后续治疗非常重要；应注意不适当的睾酮或hCG治疗有导致乳房发育的可能，对于自幼以女性社会性别抚养长大且不愿更换性别的患者而言，早期性腺切除可避免青春期男性化的发生。然而，对于AR突变的部分型雄激素不敏感综合征患者若合并导致性腺发育不良基因的突变(如NR5A1等)，除了早期的Leydig细胞功能评估外，其激素治疗方案应遵循个体化原则。对携带双基因(多基因)突变患者而言，遗传咨询增加了难度，需要对父母及家系成员的DNA进行相关基因的筛查，其后代的比例不适合用孟德尔遗传规律进行推测。
未来，随着人类基因组计划的圆满完成和测序技术的不断发展，二代测序技术的应用领域越来越广泛。除了检测基因组差异外，其在转录组测序(RNA-seq)和表观遗传学测序(甲基化测序和CHIP-seq)方面同样重要。当前，虽然DSD患者诊断率得到很大提升，但仅从基因组水平而言，相当一部分DSD患者无法获得确诊，转录水平甚至是转录后翻译修饰过程可能成为未来研究的新方向。目前采取整合多学科力量进行多学科联合诊疗(MDT)方法以提高DSD患者的诊治效率，改善其预后。快速而廉价的DNA测序能力可促进DSD患者的早期基因诊断，有助于MDT团队选择更合理的药物手术相结合的长期治疗方案，并提供准确的遗传咨询信息。未来基因组学将成为生物学研究领域的常规方法，致力于提供更全面、更便捷的遗传信息，引领我们开辟一系列新的研究领域。
结语
综上，目前针对DSD传统的基因诊断方法已不适用，新一代测序技术将取而代之。新形势下，通过运用新的测序技术方法以寻求建立DSD患者基因型与表现型之间良好关系，并试图在基因组水平上对其进行分类将成为该研究领域未来工作的重点，以全面改善这类疾病的长期预后，为罕见病的研究提供新的思路。
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