年2月25日，GenomeMedicine杂志刊文一项研究，提出一种新型常染色体隐性疾病，其典型症状为严重发育迟缓、白内障伴或不伴小头畸形。并通过CRISPR/Cas9基因编辑引入了一种具有同源突变的热带爪蟾动物，再现了人类疾病的特征，包括小头畸形和白内障，其致病基因为编码共溶体蛋白复合物的COPB1基因导致。
内膜系统由一组细胞器（包括内质网、高尔基体和内质网-高尔基中间隔室）组成。它可以通过真核细胞的分泌途径修饰、包装和运输蛋白。蛋白-外壳复合物包括共溶体蛋白I（COPI）复合物、共溶体蛋白II（COPII）复合物、许多衔接蛋白（AP）复合物，包括网格蛋白衔接蛋白复合物和逆转录酶复合物。这些蛋白表面选择靶点（蛋白质和脂质）运输和促进运输囊泡的形成。蛋白外壳的生物功能是一个基本的细胞过程，敲除小鼠COPI和COPII的某些亚单位，如COPB2，对胚胎是致命的。癌细胞中COPI的缺失导致细胞存活率降低、自噬受损和内质网应激等。
COPI由七个亚单位组成（α、β、β、γ、δ、ε和ζ）。COPI亚基可分为F-亚复合物（包含β、γ、δ和ζ亚基）和B-亚复合物（α、β′和ε）。含有β-COP的亚复合体类似于网格蛋白AP亚复合体。β-COP和γ-COP都包含一个α-螺线管“主干”结构域，通过连接体连接到一个小的附属结构域中。
图COP1复合物的结构和功能。COPI由支架“B-亚复合物”（蓝色）和“F-亚复合物”（绿色）组成。当GTP结合时，两个ARF1小GTPase分子与膜结合，并通过β-COP和γ-COP亚基与COPI结合。如图所示，这种复合物的许多亚单位与人类疾病有关。COPI复合物和它们的ARF1分子结合成三联体。运输蛋白，如内质网蛋白需要返回高尔基体，是通过直接结合COPI亚单位或间接通过跨膜受体，反过来又与COPI结合选择。COPI在膜上聚合，使其变形/弯曲，最终使运输囊泡孕育和断裂。当释放时，囊泡的外壳脱落，ARF1和COPI分离。
COPI的α、β两个亚基是本研究的重点。
临床资料
家系1
罗马家族。IV2号女性患者出生时足月体重3.25千克（0.2SD）。产前超声检查无异常。在新生儿期，她被发现有颈部倾斜，母乳喂养，声音低沉，在其8个月龄时因无法独坐且表型冷漠而就诊。早期运动里程碑被严重落后。她现在可以上下楼梯，但不能爬。语言发育落后，在其3岁时叫“妈妈”。后语言能力有所进步，并可进行简短的说话，并遵循两步走的指令。目前说话仍不清楚，但家人可以理解。她的头围为-2.6SD。
该患者具有反复上呼吸道感染和扁桃体炎史。初期眼部检查正常，左侧核硬化性白内障在其13岁时被首次发现，并与致密性弱视发展有关，此时也出现发散性斜视。月经初潮提前至9岁发生，在童年后阶段出现食欲增加、体重增加、黑棘皮（腋窝）和面部多毛症。尚未发生癫痫，婴儿期脑部CT正常。
IV3号病人是IV2患者的妹妹，产前诊断无异常。在其新生儿时期声音低沉。与其姐姐一样，她早期运动里程碑严重落后。其步态不稳，爬楼梯有困难，一只脚为扁平足畸形并用矫形鞋进行康复训练。其患有先天性耳聋，听力仅65–90dB，伴有GJB2c.71GA纯合变异。其不会说话，很难表达自己的需求，尤其是痛苦时。其可理解一些简单指令，比如“给我”。早期眼部检查是正常，在7岁时出现双侧白内障，8岁时接受人工晶体植入治疗后视力恢复正常。其小头畸形比她姐姐严重，目前测量值为-3.2SD。
其14岁时出现局灶性癫痫。发作间期脑电图正常，应用左乙拉西坦控制癫痫发作，月经初潮发生在11岁。与其姐姐一样，在儿童期后期出现食欲增加、体重增加、面部多毛和腋下黑棘皮病。
除了IV2和IV3外，三个表亲也存在小头畸形、发育迟缓，并在儿童时期早逝（IV5、IV6、IV7）。无进一步的表型信息，也无法进行基因检测。
在体格检查方面，IV2和IV3均存在向上倾斜的眼睑裂及逐渐变细的手指。
图COPB1突变个体的家系和临床表现。A.家系1包括两个受累个体，IV2和IV3。IV5、IV6和IV7也被怀疑患有小头畸形和发育迟缓。他们在幼年时期就去世了，目前暂无详细信息。IV2和IV3具有轻微面容畸形，眼睑裂向上倾斜。B.家系2包括来自两个核心家庭的四名受累个体，均来自同一沙特部落。C.家系1中RT-PCR扩增产物的凝胶电泳显示纯合状态（IV2，受累个体）和杂合状态（ii1，未受累亲本）有2条带。D.杂合子父母和纯合先证者的A带和B带电泳图。在先证者中，由于GT突变产生了一个新的供体位点，G被删除。在B带中，外显子8被跳过（先证者和父母）。
家系2
包括来自两个核心家庭的四名受影响个体，均来自同一沙特部落。暂无法获得该家庭产前和早期新生儿信息。这四个患者均具有严重智力障碍，语言障碍在该家族中是严重程度不同（患者IV8在15岁时被描述为语言正常，IV4在11岁时说话受限，而IV9和IV7分别在17岁和11岁时均无法说话）。所有患者均具有严重社会功能障碍，完全依赖个人护理。IV9和IV4具有严重小头畸形（3个标准差）。四位患者均患有白内障，IV9患者接受了手术治疗。这个家族中受累个体均运动受限，均出现了痉挛，运动技能迟钝。IV7和IV8需使用轮椅，而IV9和IV4不能独坐或独站。IV9有肌张力障碍。
另外4例受累个体存在严重淋巴细胞减少表现。具体来说，T细胞淋巴细胞减少与非常低值的CD3+CD4+细胞。免疫球蛋白水平总体正常；然而，患者未能对任何特定抗原产生抗体反应。但未发现严重联合免疫缺陷相关基因的变异信息。
变异信息
家庭1
已知家族1携带大小约kb的12；13插入易位。这在个体III2和个体IV2中以平衡易位形式存在，在个体IV3和IV1（表型正常）中为染色体13q13.3重复，在个体IV4（表型正常）中为染色体13q3.3的缺失。拷贝数变异体包括与单基因疾病无关的TRPC4（OMIM#）和UFM1（OMIM#）。临床实验室已将缺失和重复分类为可能良性变异。IV2被发现有一个纯合GJB2c.71GA变异，确定为耳聋病因。
全外显子组测序显示在目前已知致病基因中均无双等位基因预测的致病性变体（共鉴定出17个基因的18个纯合变异）。对非OMIM注释基因中的变异进一步审查确定了COPB1基因的纯合c.+1GT变异，其影响外显子8供体位点的+1位置（Chr11（GRCh37）：g.CA）。父母和未受影响的兄弟姐妹都被发现是这种变异的携带者，患者IV2和IV3为纯合子。四种预测工具是一致的，均提示供给区缺失。另外，剪接软件还预测在野生型外显子8供体位点前1个核苷酸将产生一个新的供体位点，导致1个核苷酸的移码。
家系2
对所有受累家庭成员和几个未累亲属（8人）进行了WGS检测。只有一个符合分离的纯合子变异被鉴定出来。所鉴定变异为纯合的COPB1错义变体，外显子14中的c.TG导致p.PheVal（Chr11（GRCh37）：g.AC），属于β-COP主干结构域。PolyPhen2预测该变体可能具有破坏性，SIFT预测有害，CADD（PHRED评分）预测有害。
Phe是一种高度保守的残基，从人类到酵母菌（图3b）均保守，PhyloP评分高达5.21（-14.1；6.4），Grantham评分适中为50（0-），ConSurf评分高达8/9。使用gnomAD数据库评估等位基因频率。家族2变异体（c.TG，p.PheVal）缺失。
在β-COP蛋白与COPI的其他成分的复合物的3D结构上对这种突变进行了建模。这表明突变位于主干结构域内，但远离其与ARF1和COPI亚单位的结合位点。其意义更可能是其对内部β-COP结构完整性的影响。PheVal位于连接两个α螺旋的一个弯折处或一个环上，这可能影响随后螺旋的方向性或蛋白质的折叠（图3d）。为了调查这些预测，进行了进一步的功能研究。
COPB1蛋白的结构和保守性，错义变体的结构效应。
A.COPB1（β-COP）结构的简单示意图显示了两个主要结构域：主干域和附属域，以及位于主干域N端的c.+1GT和p.PheVal变体的相对位置。
B.COPB1（β-COP）结构，其中12个氨基酸（红色）的位置由于c+1GT变异引起外显子8的跳跃而被删除。
C.COPI复合物背景下的COPB1（β-COP）结构。注：外显子8（红色）构成了复合体之间的重要关联。
D.COPB1氨基酸序列比对显示，在所有被测物种中Phe具有非常高的保守性。
E.COPB1与COPB2和COPG1复合物的三维结构模型显示了Phe在与COPG1相互作用位点附近的位置。
F.显示PheVal突变在躯干区域的高分辨率图像。
为了研究β-COP截断的表型效应，该研究使用CRISPR/Cas9将插入和缺失（InDels）引入热带爪蛙copb1中，该位点与参与家系1中发现的变异位置相邻。现在有大量证据表明，在热带爪蛙身上制备靶向InDels非常有效，因此可对动物的表型进行分析。与F1或F2代动物的出现相比，这使得对疾病中基因变异因果关系的检测更为可靠且快速。人类和热带爪蛙的copb1基因外显子结构相似，它们的copb1蛋白质具有95%以上的同源性，并且包含患者变体的两个区域都是保守的。
为了尽可能地模拟家族1的人类基因组变化（家族1；外显子8），设计了sgRNAs在热带爪蟾copb1外显子8末端产生双链DNA断裂（DSB）。胚胎目标基因组区域分析显示，外显子8和外显子8中的indels均跳跃。来自两组不同胚胎的RT-PCR显示，在注射的胚胎中存在显著的、一致的外显子跳跃水平。RT-PCR产物的Sanger测序证实了靶区几种不同转录物的表达，包括跳跃外显子8的转录物和保留外显子8但包含缺失和插入的转录物。对单个蝌蚪基因组DNA的PCR产物测序证实，嵌合体水平很高，很少有细胞在目标位点保留未改变的DNA序列。CRISPRed基因座的PCR产物被亚克隆并单独测序，表明发生了一系列从5到41bp的缺失。这些大缺失延伸到内含子，并与胚胎显示外显子8跳跃有关。
图靶向CRISPR/Cas9破坏copb1外显子8在体内产生一系列插入缺失变异。热带爪蟾copb1有21个外显子，包括一个未翻译的第一外显子（A）。CRISPR/Cas9定向的indel形成使用2个sgRNAs（红色：sgRNA3和sgRNA4（B））破坏热带爪蟾外显子8导致纯合移码和剪接变化，类似于在患者亚群中确定的变化。热带爪蟾的基因分型分析详述了在PCR扩增和亚克隆Sanger测序（C）后注射sgRNA3的三组10只蝌蚪（NF41）的indels范围。在gDNA亚克隆中观察到的41bp缺失延伸到内含子区域，并被认为诱导热带爪蟾蝌蚪的外显子8跳跃。从10个个体的4组（未注射对照组（1）、copb1sgRNA3crispant组1（2）和copb1sgRNA3crispant组2（3）、注射对照组（4））获得总RNA，并使用引物设计的反转录预混合2合成cDNA。在copb1区域的扩增显示在?bp处有一条带（外显子：7、8和9）。
两个靶向外显子的sgRNA在独立实验中产生了相同的表型，表明表型不是由于脱靶dsb引起的。这两组蝌蚪都有单侧白内障、小头畸形和偶发性无眼症。使用CRISPRScan和Cas-OFFinder对所选择的sgRNA进行了潜在的脱靶位点测试，均未检测到任何显著的命中。由于这两个程序都使用了以前版本的基因组，我们使用BLAST对热带爪蟾基因组版本10重复了这个过程。在这种情况下，检测到一个潜在的脱靶位点，但位于基因间区域。与上述实验证据一起，这表明观察表型是由于目标位点的删除。
图野生型和转基因F0代热带爪蟾crispants表型为主要临床特征。图像显示正常情况下蝌蚪头部的结构形态（A-C）和观察到的各种表型：轻度小头畸形（D-F）、伴有白内障的小头畸形（G-I）和眼睛结构缺失或缺失的小头畸形（J-I）。GFP荧光图像上的白色箭头显示未注射对照动物的前脑结构正常（B），变异的前脑结构改变，小头畸形的严重程度增加（E，H，K）。红色箭头在高分辨率MicroCT成像中显示了相同的前脑结构趋势（1%磷钨酸对比染色：C，F，I，L）。在明亮视野和MicroCT图像中，黄色箭头（G，I）表示白内障形成，在荧光成像中，绿色箭头表示GFP表达缺失（H），而绿色箭头表示眼睛结构缺失（J，L）。在30只未注射的蝌蚪和30只crispant蝌蚪（外显子8，sgRNA3）中发现再次发生的眼部异常，显示白内障形成（平均14只蝌蚪）和眼部结构缺失（平均5只蝌蚪）的患病率。此外，在受精后3天（对照组平均1?mm，标准差0.02；crispant平均0.?mm，标准差0.12（t=?3.；p=?0.））和受精后5天（对照组平均6.37?mm，标准差0.29；crispant平均5.34?mm，标准差0.20（t=?8.；p=?0.）显示大脑长度持续显著缩短。以前脑到后脑的距离测量的大脑长度表示为对照组平均值的百分比（N）。Kaplan-Meier对50只未注射对照组（中位生存时间4.4天）和热带爪蟾蝌蚪的存活率分析显示，在单细胞期注射sgRNA1（外显子3，中位生存时间2天）或sgRNA3（外显子8，中位生存时间3天）的存活率存在显著的统计学差异p=?0.（O）。
家系2错义变异模型的建立
研究假设家系2变异（c.TG，p.PheVal）影响β-COP的局部结构和折叠，这可能影响其在COPI复合物内相互作用的整体亲和力，并进行体外分析以进一步评估这一点。
利用定点突变技术产生突变型COPB1-cmyc-DDK标记质粒，并通过Sanger测序证实突变成功。将这些质粒转染到HEK细胞中，然后用10μg/ml放线菌酮处理以抑制蛋白质合成，从而提供更可靠的蛋白质稳定性测试。16h后裂解细胞，提取蛋白，SDS-PAGE和Western印迹分析。在WT和MT蛋白之间，仅观察到β-COP-cmyc条带强度之间非常细微的差异。密度测定分析显示，β-COPc.TGp.PheVal的相对标准化水平（标准化为β-肌动蛋白负载对照）低于β-COPWT水平，表明突变体β-COP的蛋白质稳定性轻度降低。
图COPB1基因突变对β-COP蛋白体外定位及稳定性的影响。
a.转染野生型和c.TG（c-myc标记的COPB1，c-myc抗体免疫印迹检测COPB1，β-肌动蛋白抗体作为负载对照）的HEK细胞蛋白质提取物的Western印迹图像。c、TG显示标准化水平略有降低。
b.用野生型COPB1（上行）和用c-myc标记的copb1c.TGp.PheVal（下行）核变异的hTERT-RPE1细胞的免疫荧光图像。细胞用高尔基染色Bodipy-TR-神经酰胺（红色）、核染色DAPI（蓝色）和抗myc免疫染色（绿色）。突变体的表达显示β-COP在高尔基体和高尔基体外更广泛的细胞质中呈弥漫性染色。比例尺?=?5?μm。
c.用c-myc标记的野生型COPB1（上行）和copb1c.TGp.PheVal（下行）核变异的hTERT-RPE1细胞的免疫荧光图像。细胞用核染色DAPI（蓝色）染色，高尔基蛋白giantin（绿色）和抗β-COP（红色）抗体免疫染色。这说明野生型β-COP倾向于定位于高尔基体的边缘，而突变型β-COP则定位于整个高尔基体。比例尺?=?10?μm。
以上为全部实验研究内容，在本文中，研究团队提出了一个新型综合征，其特点是严重发育迟缓和白内障，大多数病人具有不同程度的小头畸形。家系2受累患者也表现出痉挛和免疫缺陷，而家系1受累患者从儿童晚期即表现出“代谢综合征”表型。研究模型反映了这种高度异质的表型，一些非洲爪蟾既有小头畸形，也存在白内障，其他爪蟾则受到严重影响。鉴于COPI的主要作用是从高尔基体返回内质网驻留分子，与错义结构表达相关的定位异常可能对内膜系统的正常功能产生显著影响。由于家系1中的剪接变异导致bp外显子的跳跃，导致蛋白质中36个氨基酸的框内缺失，并假设错义和剪接变异都是亚型，保留了一些功能。我们进一步假设空等位基因在哺乳动物中可能是胚胎致死的，就像其他一些共染色体亚单位一样。这一假设得到了爪蟾动物建模的数据支持，其中copb1外显子3中的移码indels是使用CRISPR/Cas嵌合引入。这些基因敲除动物的存活率非常低，存活动物表型与外显子8携带indels胚胎相似。
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