今天分享的是发表于ScientificReports的文章Mesenchymalstemcell-ladenanti-inflammatoryhydrogelenhancesdiabeticwoundhealing。该文章的通讯作者是马尼托巴大学机械工程系、生物化学系和医学遗传学系的MalcolmXing教授、南方医科大学病理学张璐教授和南方医科大学基础医学学院组织与胚胎学系张琳教授。
本研究的目的是使骨髓间充质干细胞(BMSCs)在慢性创伤治疗中发挥最大潜能。以生物相容性的多功能交联剂为基础的温敏水凝胶为载体，可改善伤口的慢性炎症微环境。一项详细的体外研究发现，该水凝胶适合用于骨髓间充质干细胞的包封，并能促进骨髓间充质干细胞分泌TGF-β1和bFGF。在体内，在db/db小鼠背上制作全层皮肤缺损来模拟糖尿病性溃疡。结果表明，水凝胶可以抑制炎性前M1巨噬细胞的表达。水凝胶联合BMSCs治疗创面后，水凝胶+BMSCs组创面收缩明显更大。组织学和免疫组织化学结果证实，这种治疗促进肉芽组织形成、血管生成、细胞外基质分泌、创面收缩和再上皮化，有助于糖尿病皮肤创面的快速愈合。这些结果表明，满载BMSCs的水凝胶可能是一个有前途的治疗策略，以管理糖尿病溃疡。
作者开发了可生物降解的多功能交联剂和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为基础的热敏水凝胶来携带BMSCs治疗糖尿病溃疡。该交联剂含有RGD样基序，可促进BMSCs细胞的附着和分化。作者推测，水凝胶可以抑制慢性炎症，为骨髓间充质干细胞的功能提供合适的环境，并认为载于水凝胶中的骨髓间充质干细胞可以促进伤口愈合。在本研究中评估了在糖尿病溃疡模型中，局部给药带有这种热敏水凝胶的BMSCs对慢性炎症、伤口收缩、ECM分泌、血管生成、再上皮化、毛囊和皮脂腺再生以及瘢痕形成的治疗效果(图1)。
图1：本研究的主要假设
水凝胶的合成与表征
作者使用多功能交联剂与NIPAM共聚制备了三维水凝胶体系，如图2所示。根据图3A，聚合物在室温下呈现溶胶状态；在33℃水浴中浸泡后，在几分钟内发生溶胶-凝胶转变。图3B显示了冻干水凝胶均匀的多孔结构。利用DTT溶液模拟还原环境，还原环境对二硫键降解起关键作用。如图3C所示，水凝胶在DTT溶液中缓慢降解。
图2：PNIPAM-PAA热敏水凝胶的合成
图3：水凝胶的物理性质表征
水凝胶生物安全分析
将骨髓间充质干细胞接种在水凝胶表面，以检测水凝胶是否适合培养骨髓间充质干细胞。如图4A、B所示，BMSCs可以粘附在水凝胶上并在其上增殖。此外，水凝胶还能促进BMSCs分泌生长因子。如图4C所示，第1天，水凝胶组分泌的bFGF浓度不高于对照组；然而到第3天，两组之间的这些浓度有显著差异。
图4：水凝胶生物相容性试验
水凝胶+骨髓间充质干细胞联合治疗促进伤口收缩
首先观察一般术后创面愈合情况，并计算剩余创面面积(图5A、B)。结果显示，与对照组和水凝胶组相比，水凝胶+BMSCs组在治疗后第5天创面收缩明显更大。由于肌成纤维细胞的牵拉作用，导致了伤口收缩，而肌成纤维细胞表达大量的-SMA。因此研究了创面处的-SMA表达情况(图5C)。定量分析各组细胞的细胞间-SMA的表达情况发现，在第5天和第7天，水凝胶+BMSCs组细胞间-SMA的表达均明显高于对照组和水凝胶组，而在对照组和水凝胶组之间，未见显著差异(图5D)。
图5：联合水凝胶+BMSCs治疗促进伤口收缩
水凝胶抑制慢性炎症
巨噬细胞是创伤中的主要炎症细胞，有两种表型：M1和M2。M2巨噬细胞是血管生成和伤口愈合所必需的，而M1巨噬细胞是促炎细胞；因此作者检测了M1和M2巨噬细胞的表达。在本研究中，用CD86标记M1巨噬细胞，用CD标记M2巨噬细胞。如图6A、B所示，对照组CD86阳性细胞(M1巨噬细胞)水平明显高于水凝胶组和水凝胶+BMSCs组。此外，如图6C、D所示，CD(M2巨噬细胞)在对照组、水凝胶组和水凝胶+BMSCs组第5天和第7天的表达均无显著差异。
图6：水凝胶治疗可抑制伤口部位的慢性炎症反应
水凝胶+BMSCs联合治疗促进肉芽组织形成
如图7A所示，治疗5天后，与对照组和水凝胶组相比，组织学观察显示，水凝胶+BMSCs组在创口处形成了明显的肉芽组织，肉芽组织结构疏松，组织内细胞众多。治疗7天后，水凝胶+BMSCs组肉芽组织增多，结构致密。相比之下，对照组和水凝胶组在第5天和第7天都没有形成明显的肉芽组织。采用Masson三色染色法检测肉芽组织内新生的胶原纤维和新生血管。治疗5天后，与对照组和水凝胶组相比，水凝胶+BMSCs组开始形成少量胶原纤维(图7B)，第7天胶原纤维形成更多。此外，在第5天，水凝胶+BMSCs组肉芽组织内观察到新生血管(图7C)，并且有血流入这些空腔。
图7：联合水凝胶+BMSCs治疗促进肉芽组织形成
水凝胶+BMSCs联合治疗可促进角质形成细胞增殖分化
角质形成细胞的增殖和分化是上皮形成的关键步骤。为探讨创面的上皮化情况，采用免疫组化染色检测K6和K1的表达，K6作为角化细胞增生的指标。图8A、B显示，与对照组和水凝胶组相比，水凝胶+BMSCs组处理5天后K6表达水平显著升高，而K6的表达在水凝胶组和对照组之间无显著差异。K1是角质形成细胞终末分化的指标；因此在治疗后14天和21天比较了三组被检查的伤口重新上皮化部位K1的表达。图8C、D显示，与对照组和水凝胶组相比，水凝胶+BMSCs组中K1的表达显著升高。到第21天，三组之间在重新上皮化的伤口部位K1的表达没有显著差异。
图8：联合水凝胶+BMSCs治疗可促进角质形成细胞的增殖和分化
水凝胶+BMSCs联合治疗提高创面愈合质量
皮肤伤口愈合后最终形成疤痕。从治疗后35天的图9A、B中可以看出，一般观察显示BMSCs+水凝胶组的平均疤痕面积与对照组和水凝胶组有显著差异，并检测表皮再生。2型糖尿病转基因小鼠的正常表皮由一层或两层角质形成细胞组成；基底角质形成细胞的排列松散。图9C显示了三组治疗21天和35天后瘢痕中部的表皮结构。发现在治疗后的第21天和第35天，BMSCs+水凝胶组的表皮结构与对照组相似。虽然对照组和水凝胶组没有容易识别的基底层，但表皮已经过度分化，没有细胞核。进一步分析再生真皮的结构后，3周和5周的治疗。如图9DE所示，与对照组和水凝胶组相比，BMSCs+水凝胶处理的创面边缘毛囊数量明显增加。此外还观察了新生皮脂腺在伤口部位。图9F为新生儿皮脂腺分布。在水凝胶+BMSCs组，皮脂腺不仅在创面边缘还在创面中心再生，而在对照组和水凝胶组皮脂腺仅在创面边缘再生。图9G清晰显示了三组皮脂腺的再生情况。
图9：联合水凝胶+BMSCs治疗可提高创面愈合质量
在本研究中，作者研究了溃疡愈合的质量，在水凝胶+BMSCs组中出现了有趣的结果，如表皮结构完好，毛囊和皮脂腺再生。既往研究报道BMSCs在体内外均可分化为新的角化细胞、皮脂腺细胞和毛囊细胞，局部移植BMSCs可促进表皮、毛囊和皮脂腺的形成，显著提高创伤愈合质量。在本研究中，不仅在再生组织周围发现了几个新生毛囊和皮脂腺，而且有趣的是，在瘢痕组织的中心部位发现新生毛囊和皮脂腺；作者认为这可以归因于骨髓干细胞效应。
DOI:10./srep